روش های PCR آنالیز باکتری ها با روش های مختلف ✅ معرفی تجهیزات لبنیات

روش های PCR

در سال های اخیر همراه با روش RAPD برخی روش های انگشت نگاری بر پایه روش های PCR توسعه پیدا کرد. برخلاف روش RAPD اکثر این روش ها از پرایمرهای اختصاصی استفاده می کنند . روش های PCR بسته به محصول مورد نظر در دسترس است. یکی از تکنیک های انگشت نگاری بر پایه این روش بر پایه توالی عنصر تکراری است.

در روش های PCR سه نوع عنصر تکراری مدنظر است که عبارتند از عناصر پالیندرومیک (واروخوانی) اکستراژنیک تکراری (REP)، توالی های عمومی مکرر اینترژنیک باکتری های روده‌ای (ERIC) و عناصر تحت عنوان  BOX یک روش ساده و سریع که قادر به تفریق در سطح تحت گونه ای است. در واقع روش Rep-PCR روش سریع انتخابی در تعیین نوع DNA در نمونه کلینیکی شد.

👇 برای خرید دستگاه های لبنیاتی با گروه هیمورا تماس بگیرید. 👇

روش REP-PCR

روش  REP-PCR  با استفاده از هر دو مجموعه پرایمرهای REP و ERIC در یک مطالعه  بررسی دینامیک باکتری های اسید لاکتیک پنیرهای چدار در طی رسیدن استفاده شد . در مجموع ۳۸۰ جدایه لاکتوباسیلوس از چهار پنیر به دست آمد. یک نمونه کنترل پنیر در روش های PCR  تهیه شده از شیر خام ( پنیر تهیه شده با پایه شیر به اضافه ده درصد شیر تغلیط شده ) و دو پنیر حاوی ترکیبات کمکی ( دوسویه مختلف لاکتوباسیلوس پاراکازئی تحت گونه پاراکازئی ) نیز در مطالعه مورد استفاده قرار گرفت در روش Rep-PCR ۱۶ پروفایل مجزا از ۳۸۰ جدایه به دست آمد.

با استفاده ازروش های PCR خاص گونه ای، نماینده هر یک از پروفایل های Rep-PCR شناسایی شده که به صورت هشت لاکتوباسیلوس پاراکازئی، پنج لاکتوباسیلوس کاررواتوس و سه لاکتوباسیلوس پلانتاروم نشان داده شدند. پروفایل های – Rep PCR مشاهده شده در دو نمونه پنیر حاوی ترکیبات کمکی در طی دوره رسیدن  با این روش مرتبط با همان سویه هایی بودند که به عنوان ترکیبات کمکی استفاده شده اند.

هرچند ایزوله های مربوط به پروفایل پنیر حاوی ترکیبات کمکی، همچنین از پنیر تغلیظ شده کشت شده و یکی از همان پروفایل ها در پنیر کنترل نیز دیده شد. پروفایل دوم Rep-PCR نشان داده شده توسط ۵ درصد جدایه ها در یکی از نمونه های پنیر حاوی ترکیبات کمکی تنها بعد از ۱۲ ماه دوره رسیدن مشاهده شد.

تفاوت های بارز تحت گونه ها

به طور کلی، در روش Rep-PCR مشاهده گردید که گونه های لاکتوباسیلوس پنیر کنترل و پنیر تهیه شده از شیر خام مشابه یکدیگر بود. ولی تفاوت های کاملاً بارزی در نوع تحت گونه ها و دینامیک این پنیرها در طی دوره رسیدن با روش های PCR  مشهود بود. از جمله سویه کمکی لاکتوباسلیوس پاراکازئی تحت گونه پاراکازئی در پنیرهای چدار به عنوان یک سویه غالب در طی دوره رسیدن مشاهده شد.

روش Rep-PCR در برخی پژوهش های مقایسه ای برای ارگانیسم های مختلف مورد نظر، قدرت تفریقی بیشتری نسبت به سایر تکنیک ها از جمله انگشت نگاری ژنتیکی نشان داده شده است.

توانایی روش آنالیز RAPD

آندریکتو و همکاران ۱۹۹۸ نشان دادند که روش آنالیز RAPD  همانند روش های PCR قادر به شناسایی و تفریق همان باکتری های اسید لاکتیک در سطح گونه است، اگرچه چندین پروفایل باندی حاصل از RAPD لازم است که مستلزم استفاده از بیش از یک پرایمر و یا آنالیز آنزیم های محدودگر تولید کننده محصولات حاصل از تکثیر است.

نکته جالب توجه این است که سویه های وحشی لاکتوباسیلوس دلبروکی تحت گونه لاکتس جدا شده از شیر خام باعث انگشت نگاری پیچیده تری به روش Box Rep-PCR همراه با باندها و تنوع بیشتری نسبت به ایزوله های جدا شده از محصولات تجاری می شود.

این داده ها به روشنی اعتبار استفاده از روش های PCR را جهت تشخیص و شناسایی میکروب های کشت های مایه ثابت می کند. به طور کلی کاربرد اصلی روش های انگشت نگاری ژنتیکی، مطالعات تفریقی بر روی سویه های باکتریهای جدا شده قابل کشت هستند.

توانایی تفریق باکتری های اسید لاکتیک در روش های مولکولی

این روش به میزان زیادی توانایی تفریق باکتری های اسید لاکتیک به ویژه گونه های مرتبط با هم را افزایش داده است .بسیاری از آنها از لحاظ آزمایشات فنوتیپیکی غیر قابل تشخیص هستند. امکان گسترش کاربرد تکنیک های مولکولی در زمینه باکتری های غیر قابل کشت اهمیت فراوان دارد. بزرگترین مانع این روش، ماتریکس مواد غذایی است؛ هرچند با تحقیق و بهینه سازی در آماده سازی نمونه و پروتکل های استخراج DNA می توان بر این مشکلات فائق آمد.

در حال حاضر چنین پیشرفت هایی در حال انجام است؛ به ویژه استفاده از گرادیان دناتوره ژل الکتروفورز (GGE) . انواع روش های PCR جهت شناسایی و یا تفریق باکتریک های اسید لاکتیک در حال توسعه است. بسیاری از این روش ها یا بر پایه تکثیر به تنهایی و یا برپایه تکثیر قطعه خاصی با استفاده از پرایمرهای PCR اختصاصی گونه ها است. تعدادی از مناطق مورد هدف برای این روش ها مشخص شده که عبارتند از ژنهای 16srRNA توالی های بین ژنی 23-165 (IST) ژن های پروتئین شوک حرارتی  (hp)، ژن های red .

تضمین کیفیت و کنترل عملکرد کشت های پروبیوتیکی

لیستی از پرایمرهای ویژه گونه و سویه باکتری های اسید لاکتیک در حال افزایش است. در روش های PCR کاربرد پروب به عنوان مکانیسم عمل جهت شناسایی و تفریق کشت ها و جمعیت های باکتری های اسید لاکتیک پیشی گرفته است. همچنین موج کاربرد PCR در زمان واقعی برای باکتری های اسید لاکتیک به سرعت در حال نزدیک شدن است. تنها به دلیل مسأله زمان است؛

اینها جایگاه ویژه ای برای تضمین کیفیت و کنترل عملکرد و دینامیک کشت های پروبیوتیکی در طی تولید، نگهداری و مصرف فرآورده ها را دارند. روش Multiplex PCR چندین جفت پرایمر در یک واکنش استفاده می شود تا به طور همزمان چند منطقه هدف بر روی DNA تکثیر شود تا دقت و قابلیت اطمینان روش را افزایش دهد.

Multiplex PCR

لوکینین و همکاران ۱۹۹۸ با استفاده از روش Multiplex PCR به طور ویژه پروبیوتیک لاکتوباسیلوس کاسری سویه 4B2 از جدایه های مدفوعی رشد داده شده در محیط های کشت انتخابی را ردیابی کردند.

در این روش بهبود شرایط واکنش یکی از بزرگترین موانع بوده و به طور مشابه در استراتژی های با استفاده از پروب، ترکیب چندین پروب الیگونوکلئوتیدی این مشکل وجود دارد و تنها این مانع، زمانی کاهش می یابد که از جفت پرایمرهایی استفاده شود که مشخصات واکنشی مشابهی به ویژه دماهای چسبیدن داشته باشند.