آزمون آغازگر های لبنیاتی – اهداف و مراحل آزمون✅- هیمورا

شرایط لازم برای آزمون آغازگر ها

انواع انتخاب شده ای از باکتری های مولد اسید لاکتیک (مثل استرپتوکوکوس لاکتیس، استرپتوکوکوس کرموریس، استرپتوکوکوس ترموفيلوس ، لوكونوستوک دکسترانیکوم، لاکتوباسیلوس بولگاریکوس، لاکتو باسیلوس اسيدوفيلوس و لاکتوباسیلوس هلوتیکـوم) بــه صــورت منفرد و یا ترکیبی از چند باکتری به عنوان کشت و آزمون آغازگر ها در تولید انواعی از فراورده های شیر از جمله ماست و شیر اسیدی و شیر تخمیر شده، خامه پرورده و پنیر به کار می روند.
عمل این میکروارگانیسم ها تولید اسید و طعم و نیز کمک به انعقاد پروتئین های شیر و سایر تغییرات در شیر یا خامه است. همچنین آغازگرها عامل اصلی رسیدن پنیر هستند. از آنجا که کشت های آغازگر مستعد به آلودگی و غیر فعال شدن توسط باکتریوفاژها و دیگر ارگانیسم های ناخواسته اند، باید نهایت دقت در نگهداری و تولید آنها در آزمون آغازگر ها مبذول شود.
آزمون های زیر به منظور آشنایی هر چه بیشتر با روند تولید و نگهداری محیط های کشت آغازگر، سنجش فعال بودن و درجه خلوص آنها بیان میشود.

👇 برای خرید دستگاه های لبنیاتی با گروه هیمورا تماس بگیرید. 👇

آزمون سنجش فعالیت آغازگرها

ممکن است در مراحل تولید و تکثیر کشت های آغازگر و به دنبال آلودگی آنها با ارگانیسم های ناخواسته، کشت های مذکور ضعیف شده و فعالیت خود را از دست بدهند، که چنین آغازگرهایی برای تولید محصولی با کیفیت مطلوب مفید نیستند. بنابراین لازم است هر چند یکبار فعالیت کشت های آغازگر از نظر تولید اسید و طعم سنجیده شود. بنابراین قضاوت در مورد فعالیت آغازگر با توانایی آن در احیای رنگ آبی متیلن یا رزازورین افزوده شده به شیر و نیز تولید ترکیبات معطر فرار (دی استیل)، انجام می شود.

برای اطمینان از فعال بودن کشت های آغازگر، سه آزمون آغازگر ها یعنی تولید اسید و احیای رنگ و آزمایش کراتین به صورتی که در ادامه آمده، انجام خواهد شد.

آزمون اسیدیته آغازگر ها

روش آزمایش

• کشت آغازگر را خوب هم زده و مقدار 3 میلی لیتر از آن را به ۱۰ میلی لیتر شیر چربی گرفته شده در لوله آزمایش بیفزایید. لوله آزمایش مذکور را به مدت سه ساعت و نیم در ۳۷ درجه سانتیگراد گرمخانه گذاری کنید.
• در این مرحله از آزمون آغازگر ها تمام محتويات لوله آزمایش را با ۵ میلی لیتر آب مقطر شسته و به داخل یک ارلن بریزید و روی آن چند قطره معرف فنل فتالیین بیفزایید.
• با محلول سود 0/1 نرمال تیتر کنید.
• با ضرب کردن حجم مصرفی سود 0/1 نرمال به کار رفته برای تیتراسیون در عدد 0/09 اسیدیته را محاسبه و عدد به دست آمده را به صورت درصد اسید لاکتیک بیان کنید.

تفسیر نتایج

در این آزمون آغازگر ها اسیدیته 0/35 درصد و بالاتر بیانگر اسیدیته مناسب کشت آغازگر است.

👆 معرفی دستگاه هموژنایزر شیر گروه صنعتی هیمورا 👆

آزمون کراتین (سنجش دی استیل)

مواد لازم

• کشت های آغازگری که ایجاد دی استیل در آنها مورد نظر است
• لوله آزمایش
• محلول ۳۰ درصد هیدرواکسید پتاسیم
• كراتين

روش آزمایش

• در آزمایش کراتین به عنوان آزمون آغازگر ها کشت آغازگر را خوب مخلوط کرده و ۲ تا 5 میلی لیتر از آن را در داخل یک لوله آزمایش بریزید. سپس مقدار کمی (۱تا ۲ میلی گرم) کراتین به آن اضافه کنید.
• هم حجم با کشت آغازگر یعنی ۲ یا 5 میلی لیتر پتاس به محتویات لوله اضافه کنید.
• محتویات لوله را خوب مخلوط کرده و ۱۰ دقیقه به حالت سکون قرار دهید.
• در این آزمایش زمان لازم برای ایجاد نوار صورتی رنگ در سطح محلول را یادداشت کنید.

تفسیر نتایج

تشکیل نوار صورتی رنگ در سطح شیر که ناشی از ایجاد دی استیل است و پایداری آن بـه مدت حدود ۱۰ دقیقه، دلیل بر فعال بودن کشت مذکور از نظر تولید ترکیبات معطر است.

آزمون های تشخیص آلودگی در باکتری های آغازگر

آزمایش میکروسکوپی

گستره ای از آغازگر مورد نظر را تهیه و با روش گرم رنگ آمیزی کنید. باکتری های آغازگر همه گرم مثبت اند. در آزمون آغازگر ها وجود هرگونه باکتری گرم منفی نشانه آلودگی مایه است. با این بررسی نسبت باکتریهای مایۀ مخلوط مثل مایۀ ماست (نسبت کوکسیها و باسیلها) را نیز میتوان مشخص کرد.

👆 معرفی دستگاه گرمخانه ماست گروه صنعتی هیمورا 👆

تشخیص آلودگی با آزمون آغازگر ها

• آزمایش کاتالاز

در آزمون آغازگر ها خلوص آغازگر را با آزمون کاتالاز میتوان تعیین کرد. آغازگرهای لاکتیک همگی کاتالاز منفی اند. به این دلیل واکنش مثبت کاتالاز دلیل بر آلودگی آغازگر است.

• آزمایش کلیفرم ها

نمونه آغازگر را از نظر وجود کلی فرم آزمایش کنید.

• آزمایش کپک و مخمر

آغازگرهای لاکتیک نباید به مخمرها و کپک ها آلوده باشند. به این دلیل نمونه مورد نظر را در آزمون آغازگر ها از نظر کپک و مخمر آزمایش کنید.

تشخیص فاژ در آغازگرهای لاکتیک

شمارش استرپتوکوک های لاکتیک و تشخیص آلودگی آنها به فاژ

در آزمون آغازگر ها محیط کشت محيط جامد انتخابی برای کشت استرپتوکوک های آغازگر است. همچنین با این محیط میتوان آلودگی این میکروارگانیسم ها را به فاژ نیز تشخیص داد. در این محیط علاوه بـر استرپتوکوکوس کرموريس، لاكتيس و دی استیل لاکتیس، میکروارگانیسم هایی که قادر به استفاده از لاكتوز در متابولیسم خود هستند نیز، رشد میکنند.

اساس آزمون

اساس این آزمون به این صورت است که وجود بتا گلیسروفسفات سدیم در این محیط با افزایش ویژگی بافری خود، موجب رشد استرپتوکوک های لاکتیک و ایجاد پلاک های باکتریوفاژ خواهد شد.

ترکیب محیط M17

پیتون سويا                5گرم
پیتون گوشت              2/5 گرم
پیتون کازیین              2/5 گرم
عصاره مخمر            2/5 گرم
عصاره گوشت             5گرم
گلوکز                        5 گرم
بتا گلیسرو فسفات سدیم    19 گرم
سولفات منیزیم             0/25 گرم
آگار آگار                    12/75 گرم

مقدار 55 گرم محیط M17 را در یک لیتر آب مقطر حل کرده و در دمای ۱۲۱ درجه سانتیگراد، به مدت ۲۰ دقیقه اتوکلاو کنید. pH نهایی باید 7 باشد. محیط کشت سترون شده را در شرایط سترونی در پلیت های سترون تقسیم کرده و آنها را در یخچال نگهداری کنید. در آزمون آغازگر ها مدت زمان نگهداری در یخچال ۸-۶ درجه سانتیگراد نباید از ۱۰ روز تجاوز کند.

روش آزمون

1- آماده سازی نمونه ها

در آزمون آغازگر ها از نمونه آغازگر رقت های مورد نظر را با آب مقطر سترون تهیه کنید.

2- روش تلقیح

از رقت های تهیه شده به میزان یک میلی لیتر روی سطح محیط M17 ببرید و خوب پخش کنید. پلیت ها را در گرمخانه ۳۱ درجه سانتیگراد قرار دهید و پس از ۱۵ ساعت آنها را مشاهده کنید. قطر پرگنه های استرپتوکوک های لاکتیک پس از ۵ روز معادل ۳ تا ٤ میلیمتر خواهد بود، در صورتی که پرگنه میکروارگانیسم های لاکتوز منفی کمتر از یک میلی متر است.

3- تشخیص فاز

در صورتی که در آزمون آغازگر ها استرپتوکوک ها به فاژ آلوده شده باشند، روی محیط کشت پلاک های مجزاء و تیره دیده می شود.

👆 معرفی دستگاه پخت شیر گروه صنعتی هیمورا 👆

شمارش لاکتوباسیلوس ها و تشخیص آلودگی آنها به فاژ

در آزمون آغازگر ها محیط کشت MRS آگار انتخابی برای جدا سازی لاکتوباسیلوس ها در این محیط علاوه بر لاکتوباسیل ها، سایر میکروارگانیسم ها مثل لکونستوک ها هم رشد میکنند.

ترکیب محیط کشت آگار MRS

پیتون                  10 گرم
عصاره گوشت         5 گرم
عصاره مخمر          5 گرم
گلوکز (D+)                 2 گرم
دی پتاسیم هیدروژن دی فسفات     2 گرم
دی امونیوم هیدروژن سیترات      2 گرم
استات سدیم             5 گرم
سولفات منیزیم          0/1 گرم
سولفات منگنز           0/05 گرم
آگار آگار                12 گرم

مقدار ٦٢ گرم ترکیب محیط بالا را در یک لیتر آب مقطر حل کنید و آن را به مدت ۱۵ دقیقه در حرارت ۱۲۱ درجه سانتیگراد سترون کنید. در این آزمون آغازگر ها pH نهایی باید 6/5 باشد.

روش آزمون

1- آماده سازی نمونه

روش آزمون آغازگر ها در این مورد بدین صورت است که نمونه مورد نظر را به طور کامل یکنواخت کرده و با کمک آب مقطر سترون رقت های مورد نظر را تهیه کنید.

2- روش تلقیح

روش کشت به صورت مخلوط است. یک میلی لیتر از رقت های تهیه شده را به پلیت منتقل کنید و ١٢ تا ١٦ میلی لیتر محیط کشت ذوب شده به آن اضافه کنید. (دمای محیط کشت در حدود 45 درجه سانتیگراد باشد) با حرکت چرخشی محیط و نمونه را به طور کامل یکنواخت کرده و صبر کنید تا محیط جامد شود. پلیتها را در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد به مدت ۳ روز یا در ۳۰ درجه سانتیگراد به مدت ۵ روز نگهداری کنید. در آزمون آغازگر ها پرگنه های ایجاد شده در عمق محیط را به عنوان لاکتوباسیلوس شمارش کنید.

3- تشخیص فاژ

برای تشخیص آلودگی نمونه به فاژ، میتوان از نحوه کاهش تعداد پرگنه ها در زمان مشخص استفاده کرد. به این منظور یکی از رقت های آماده شده را انتخاب کنید. نمونه مورد نظر را در ساعت های صفر، ۳۰ دقیقه و ٦٠ دقیقه و ۱۲۰ دقیقه بعد از آماده سازی به روش کشت مخلوط و با استفاده از محیط آگار MRS کشت کنید. تعداد پرگنه های ایجاد شده در زمان های متفاوت، باید حداقل مساوی و یا ترجیحاً روند افزایش داشته باشند. اگر بعد از گرمخانه گذاری در آزمون آغازگر ها تعداد پرگنـه هـا کاهش قابل ملاحظه ای داشت، وجود فاژ در نمونه مورد نظر قطعی است.

آزمون احیای رنگ

روش آزمون

• کشت آغازگر را خوب مخلوط کرده و مقدار یک میلی لیتر از آن را به ۱۰ میلی لیتر شیر بدون چربی بیفزایید و محتویات را خوب به هم بزنید.
• برای انجام آزمایش احیای رنگ به عنوان آزمون آغازگر ها بعد از انتقال ۱۰ میلی لیتر از محتویات به لوله سترون دیگر، یک میلی لیتر محلول آبی متیلن به آن افزوده و در حمام آب ۳۷ درجه سانتیگراد قرار دهید.
• مدت زمان لازم برای زایل شدن رنگ را یادداشت کنید.

👆 معرفی تجهیزات خامه گیری از شیر گروه صنعتی هیمورا 👆

کنترل آغازگرهای قارچی

• تعیین فعالیت آغازگرهای قارچی با شمارش اسپور آنها در آزمون آغازگر ها انجام میشود.
• تعیین آلودگی آغازگرهای قارچی با کشت آنها به منظور جست وجو و شمارش کلیفــرم هـا صورت می گیرد.

کنترل دانه کفیر

• تعیین فعالیت دانه های خشک کفیر با افزایش میزان اسیدیته آن در شیر مشخص خواهد شد.
• آلودگی دانه کفیر با آزمایش آن برای جست وجو و شمارش کلیفرم ها و کپک سفید تعیین می شود.

کنترل های جانبی

در آزمون آغازگر ها تمام تجهیزاتی که برای تولید و تکثیر آغاز گرها استفاده می شوند، باید خوب نظافت شده و ضدعفونی شوند. انجام آزمون سواب برای این تجهیزات ضروری است. هم چنین می توان از آزمایش های تعیین کلیفرم کپک و مخمر بهره گرفت.