شمارش باکتری جهت کنترل سویه ها با انواع روش ها ✅ خط صنعتی لبنیات

روش های مرسوم شمارش باکتری های اسید لاکتیک

بر طبق تعریف باکتری های پروبیوتیک اسید لاکتیک و کشت های آغازگر زنده هستند. بنابراین روش های کلاسیک شمارش باکتری قابل استفاده است. برخی روش های تفریقی پلیت گذاری جهت کنترل این سویه ها وجود دارد که معمولاً نتیجه موردنظر، روش مناسب تر را مشخص می کند.

برای نمونه محیط های کشت مختلف و شرایط گرمخانه گذاری (دما، زمان، اتمسفر)، طیف وسیعی از میکروب های نمونه را پوشش خواهد داد. به طور کلی زمانی که جستجوی پروبیوتیک خاصی با کشت های آغازگر مدنظر باشد، از محیط های کشت انتخابی یا تفریقی می شود. محیط های کشت اختصاصی سبب افزایش گروه خاصی از باکتری ها می شوند.

برای نمونه محیط کشت بیرنز آگار، جهت جداسازی بیفیدوباکتری ها از جمعیت های مخلوط استفاده می شود. با وجود تعداد کمی از محیط های اختصاصی، تأیید شناسایی ایزوله ها ضروری است. محیط های کشت افتراقی بر مبنای خصوصیات رشد گروه های مختلف باکتریایی قادر به تفریق هستند.

👇 برای خرید دستگاه های لبنیاتی با گروه هیمورا تماس بگیرید. 👇

گروه بندی ارگانیسم ها توسط شناسایی کشت های مایه باکتری ها

شمارش باکتری و شناسایی مخلوط کشت های مایه باکتری های اسید لاکتیک و پروبیوتیک در برخی موارد محیط های کشت افتراقی، حتی می‌توانند به طور تجربی موجب گروه بندی ارگانیسم ها شوند. تعداد زیادی محیط های کشت آگار جهت شمارش باکتری پروبیوتیک اسید لاکتیک و کشت های آغازگر پیشنهاد شده است.

به طور خلاصه فدراسیون بین المللی لبنی، یک پروتکل استاندارد جهت استفاده از محیط های کشت MRS آگار و M17 آگار برای شمارش کشت های آغازگر لاکتوباسیلوس ارائه داد. لیست وسیعی از محیط های کشت مورد استفاده جهت شمارش باکتری های پروبیوتیک اسید لاکتیک گونه های بیفیدوباکتریوم و لاکتوباسیلوس وجود دارد و اغلب انتخاب برمبنای اولویت استفاده کننده در صنعت محیط های آکادمیک یا آژانس استاندارد دولتی است.

هیبریداسیون کلونی و پروب

محیط های کشت اصلاح شده طوری فرموله می شوند تا بازیابی بهتر بیفیدوباکتریوم ها از فرآورده های تخمیری لبنی به دست آید. چارتریس و همکاران بررسی نسبتاً گسترده ای بر روی روش های تفریقی با استفاده از شمارش باکتری جهت جداسازی گونه های بالقوه پروبیوتیک لاکتیک اسید انجام دادند.

هرچند باید به خاطر داشت که رشد بر روی محیط های کشت انتخابی جهت شناسایی ایزوله ها کافی نیست و روش های شناسایی دیگری مورد نیاز است. بنابراین به منظور شناسایی دقیق کشت های خاص باکتری های لاکتیک اسید، بایستی از روش های هیبریداسیون کلونی و پروب بهره برد.

رقیق سازی متوالی برای شمارش باکتری

به طور کلی در عمل جهت شمارش باکتری های نمونه با استفاده از روش های پلیت گذاری ابتدا یک رقیق سازی متوالی انجام شده و از هر مرحله رقیق نمودن در پلیتها ریخته و بعد گرمخانه گذاری می کنند. برای بازیابی کشت های بیفیدوباکتریایی شرایط بی هوازی لازم است. همچنین شمارش لاکتوباسیلوس ها از کشت مخلوط باکتری های اسید لاکتیک اغلب در شرایط هوازی انجام می شود تا رشد بیفیدوباکتریوم ها به حداقل برسد.

زمان گرم خانه گذاری نیز مهم است؛ به طوری که باکتری های اسید لاکتیک سریعتر از سایرین رشد می کنند. گاه بایستی رشد پلیت ها را در چند روز متوالی بررسی کرد تا اطمینان حاصل شود که پرگنه های کوچک را از دست نخواهیم داد. رقتی از پلیت ها جهت شمارش باکتری انتخاب می شود که حاوی ۲۵ تا ۲۵۰ کلونی باشند. در عمل چندین پلیت از هر رقت تهیه می شود تا محاسبه دقیق تری از محتویات قابل کشت نمونه اولیه انجام گردد.

استراتژی های کاوش گرایانه

برخی روش های جستجوگرانه برای شمارش باکتری و جهت نظارت بر ترکیب باکتریایی جمعیت های مخلوط باکتری های اسید لاکتیک وجود دارد به طور معمول سه روش استفاده می شود کلونی هیبریداسیون، هیبریداسیون دات بلات ۱۰ و هیبریداسیون درجا پرگنه های رشد یافته بر روی پلیت آکاردار به غشاهای نایلونی انتقال داده شده و سلوله ای باکتری لیز شده و DNA آزاد شده جهت هیبریداسیون با پروب های اختصاصی، به غشا تثبیت می شود. این روش شمارش باکتری ، روش دقیقی از سلول های زنده ارگانیسم خاصی را فراهم می کند. به شرطی که شرایط مناسبی جهت لیز سلولی تمامی پرگنه ها به کار گرفته شود.

در آغاز جهت شناسایی دقیق هر پرگنه باکتریایی هیبریداسیون های پرگنه انجام می شود. با افزایش و پیشرفت مجموعه پروب ها، به ویژه برای گونه های مهم تجاری و کلینیکی این امکان فراهم شده تا پروب های مناسب انتخاب شود که قادرند شمارش باکتری افتراقی باکتری های اسید لاکتیک در کشت های مخلوط پروبیوتیکی را انجام دهند.

شمارش باکتری روش دات بلات

همچنین با پیشرفت تعیین توالی ژن و توسعه پایگاه های اطلاعاتی ریبوزومی، شناسایی ایزوله ها سریع تر و کاراتر از روش هیبریداسیون پرگنه انجام می شود. از روش های دات بلات می توان جهت استخراج DNA ایزوله ها یا نمونه ها  و شمارش باکتری به طور مستقیم بهره برد برای نمونه هم برای ایزوله های قابل کشت و هم غیرقابل کشت کل اسیدهای نوکلئیک کشت های خالص کشت های مخلوط یا خود نمونه ها قابل تهیه هستند.

خلوص و بازده  و شمارش باکتری معمولاً در مقابل لدرهای استاندارد DNA و قبل از اینکه برای غشای دات بلات تنظیم شود، بررسی می شود. بسته به نوع کاربرد هم از یک میزان استاندارد DNA استفاده می شود. (مثلا یک میکروگرم) و هم یک رقت سازی متوالی از DNA استخراج شده خام و تقسیم آن به واحدهای استاندارد جهت هربار استفاده تهیه می شود. DNA دناتوره شده با استفاده از دستگاه دات بلات به غشا متصل می شود.

هنگام استفاده از هیبریداسیون های شبکه ای DNAهای استخراج شده از نمونه های مختلف معمولا در امتداد یک محور و پروب ها در امتداد محور دیگر به کار گرفته می شود. در کل مورد نظر به عنوان درصدی از کل rRNA در نظر گرفته می شود. چنین روش های شمارش باکتری و  تعیین کمیت مشکلات مرتبط با میزان کپی های ریبوزومی کشت های مختلف باکتریایی را برطرف می سازد.

تکنیک دات بلات معکوس

یک روش اقتباسی از دات بلات تحت عنوان تکنیک دات بلات معکوس، نشان داده شده که جهت  شناسایی و شمارش باکتری های اسید لاکتیک در غذاهای تخمیری سودمند است. پروب های مخصوص گونه های لاکتوباسیلوس به غشاهای فیلتری متصل می شوند. PCR غیر تخصصی جهت تکثیر ژن های rRNA نمونه ها انجام شده و محصولات مشخص شده حاصل از تکثیر به بافر هیبریداسیون اضافه می شوند و تحت فرآیند غشاهای فیلتری قرار می گیرند.

پیشرفت های اخیر در استراتژی های کاوش گرایانه برای شمارش باکتری، مانند روش های چاهکی و روش های میکروچیپ به طور مشابه از یک سیستم شبکه ای استفاده می کنند. در این موارد پروب های مشخص شده الیگونوکلئوتیدی به چاهک ها یا میکروچیپ باند می‌شوند. نمونه های DNA دناتوره شده اضافه می شوند. پروب های مخصوص گونه های بیفیدوباکتریوم نیز به همین روش استفاده می شوند.

پرایمرهای PCR

در این مورد، پرایمرهای PCR مخصوص جنس جهت تکثیر ژن rRNA به کار گرفته شد. آرایه های میکروچیپ (تحت عنوان چیپ های DNA یا میکرواری های ۱۳ DNA نیز نامیده می شوند) این توانایی را دارند که صدها و یا هزاران پروب را بر روی یک اسلاید شیشه ای بگنجانند.

چنین پیشرفت های فناوری در آنالیز جوامع اکوسیستم پیچیده میکروبی، به ویژه میکروفلور دستگاه گوارش بسیار شگفت انگیز است. اگرچه هزینه های جاری چنین فناوری ها نسبتاً گران است. تکنیک های مستقیم کاووش گرایانه برای شمارش باکتری مانند هیبریداسیون فلورسانس درجا (FISH) نیز به روش های کشت وابسته نیست. در کل سلول های باکتریایی قبل از هیبریداسیون با پروب های برچسب گذاری شده با فلورسانس با استفاده از پارافرمالدهید تثبیت می شوند.